Klimataktivisterna slog på målningen "Venus med spegel" med små hamrar. Foton visar att skyddsglaset punkterades med flera slag.
Gruppen säger att attacken mot National Gallery i London ska ses som ett krav på Storbritanniens regering att omedelbart stoppa all prospektering, utveckling och produktion av fossila bränslen i landet.
Gruppen har lett flera liknande attacker mot berömda konstverk och offentliga byggnader
Enligt organisationen valde aktivisterna Velázquez målning eftersom den också attackerades 1914 i suffragettrörelsens namn.
– Kvinnor fick inte rösträtt genom att rösta. Det är tid för handlingar, inte ord, sade klimataktivisterna i galleriet.
National Gallery uppger i ett uttalande att två personer har gripits. Målningen har avlägsnats från utställningen för undersökning.