"Jag fördömer å det starkaste det oproportionerliga och aldrig tidigare skådade, ensidiga agerandet", säger Grossi i ett uttalande.
Iran har rätt att lägga in veto mot IAEA:s inspektörer. Men enligt Grossi ligger det utanför normal praxis att stoppa flera inspektörer, som Iran hotat göra, och försvåra IAEA:s arbete.
"Jag uppmanar Iran att ompröva sitt beslut och återgå till samarbete med inspektionen", fortsätter Grossi.
Enligt diplomatkällor har Iran stoppat alla tyska samt franska experter i IAEA:s team. Teamet saknar redan amerikanska och brittiska experter.
Irans utrikesdepartement hävdar att åtgärden är ett svar på att länderna försöker missbruka IAEA "för sina egna politiska syften".
USA, Storbritannien, Frankrike och Tyskland kritiserade Iran i ett gemensamt uttalande vid atomenergiorganets styrelsemöte i Wien tidigare i veckan vecka, där de uppmanade Teheran att intensifiera samarbetet.
Storbritannien, Frankrike och Tyskland sade också på torsdagen att de kommer att upprätthålla de sanktioner som är kopplade till Irans kärnvapen- och robotprogram.
Kärnenergiavtalet JCPOA undertecknades av Iran 2015. I utbyte mot att slippa internationella sanktioner skulle Iran tillåta insyn i sitt kärnenergiprogram.