Totalt anklagas 21 personer, däribland besättningsmedlemmar på fartyg från Läkare utan gränser, Rädda Barnen och den tyska icke-statliga organisationen Jugend Rettet, för att ha "medverkat till otillåtet inträde i Italien" 2016 och 2017.
Enligt anklagelserna ska de ha "samordnat sina handlingar med smugglare strax utanför Libyen och lämnat tillbaka uppblåsbara jollar och båtar till dem så att de kunde plocka upp människor vars liv inte varit i fara".
Organisationerna förnekar att de någonsin har kommunicerat med människosmugglare och "tillbakavisar starkt" anklagelserna. Läkare utan gränser uppges vara kritiska mot att "humanitärt bistånd kriminaliseras".
Nu pågår inledande förhandlingar i rätten, som väntas bli långdragna, innan domaren ska fatta beslut om eventuell rättegång.
Den fem år långa utredningen har kantats av kontroverser kring bland annat massavlyssning av välgörenhetsarbetare, journalister och advokater. Kritiker menar att anklagelserna är ett politiskt motiverat försök att stoppa räddningsinsatserna till havs.
Italien är ett av de länder dit flest migranter har tagit sig sjövägen. I år har hittills 17 000 migranter ankommit till landet. Minst 12 000 människor har drunknat på Medelhavet sedan 2014.