De 20 tjeckiska diplomaterna måste lämnas Ryssland senast på måndag, enligt ryska utrikesdepartementet, rapporterar den statliga ryska nyhetsbyrån Ria.
Relationen mellan Ryssland och Tjeckien är frostigare än på många år – enligt politiska bedömare har den inte varit så dålig sedan landet bröt sig loss från Sovjetunionens grepp under sammetsrevolutionen 1989.
Trätan inleddes i lördags när Tjeckiens premiärminister Andrej Babis meddelade att regeringen misstänker att ryska underrättelsetjänsten var inblandad i explosionerna i ett ammunitionslager i tjeckiska Vrbetice i oktober 2014, då två personer dödades.
"Förstör grunden"
I samband med anklagelsen meddelades också att 18 ryska diplomater – med påstådda kopplingar till rysk underrättelsetjänst – utvisas från landet. Och att två av personer som var inblandade i explosionerna låg bakom mordförsöket på den tidigare ryske agenten Sergej Skripal och hans dotter i Storbritannien under 2018.
Regeringen i Moskva reagerar med ursinne på anklagelserna, och säger i ett uttalande den ska "tvinga upphovsmännen bakom provokationen att till fullo förstå sitt ansvar för att förstöra grunden till normala band mellan våra länder".
Ryssland har också svarat att anklagelserna är absurda, och att de är "en fortsättning på de antiryska beslut som Tjeckien har fattat på senare år".
Tjeckien har informerat Nato och sina allierade i EU om misstankarna. EU:s utrikesministrar ska diskutera frågan på måndagens möte.
Står bakom Tjeckien
Storbritanniens utrikesminister Dominic Raab säger i ett uttalande att landet står bakom sina tjeckiska allierade, som har "avslöjat hur långt den ryska underrättelsetjänsten är beredd att gå för att genomföra farliga och illvilliga operationer i Europa".
"Det här visar på ett beteendemönster från Moskva efter novitjokattacken i Salisbury. Mina tankar går till familjerna för offren i Vrbetice."
Även USA uttrycker sitt stöd för Tjeckien. Den amerikanska ambassaden i Prag skriver i ett uttalande att Washington står bakom sin allierade, och att man uppskattar "dess agerande för att låta Ryssland betala för sitt farliga agerande på tjeckisk mark", rapporterar Reuters.
Rättad: I en tidigare version angavs fel veckodag för EU:s utrikesministermöte.