Personerna arbetade för det nederländska Röda Korset.
Fordonet var försett med organisationens emblem, enligt ett uttalande från Röda Korset i Mali, som fördömer attacken och säger att den "underminerar det humanitära uppdraget".
Vittnen uppger att beväpnade män på motorcyklar öppnade eld mot fordonet. Förutom de två dödsoffren färdades ytterligare två hjälparbetare i bilen.
Nouhoum Maiga, generalsekreterare för Malis Röda Korset, säger till AFP att gärningsmännen troligtvis var rånare snarare än jihadister.
– Det är inte Röda Korset som sådant som var måltavla, säger han och tillägger att gärningsmännen stal bilen och utrustningen i den.
Fordonet hittades senare övergivet.