Iran var inte inblandad i attacken, sade Saeed Khatibzadeh, talesperson på det iranska utrikesdepartementet på söndagen.
Anklagelserna beskrivs som "grundlösa" av departementet.
"[Israel] har skapat otrygghet, terror och våld. Dessa anklagelser om Irans inblandning fördöms av Teheran", sa Saeed Khatibzadeh på en tv-sänd presskonferens.
"Försvarar intressen"
Saeed Khatibzadeh tillade att "Iran kommer inte att tveka ett ögonblick att försvara sina intressen och sin nationella säkerhet."
Beskedet kommer efter att såväl Israel som USA anklagat Iran för att ha genomfört attacken, som ägde rum utanför Oman och där en brittisk säkerhetsvakt och en rumänsk besättningsman dödades.
Fartyget Mercer Street är japanskägt men drivs av det israeliskägda rederiet Zodiac Maritime. Enligt bolaget var fartyget på väg från Dar es Salaam i Tanzania till Fujariah i Förenade Arabemiraten.
USA utreder
Efter attacken skyddade en amerikansk flotteskort det skadade fartyget, enligt rederiet. På lördagen meddelade det amerikanska utrikesdepartementet att USA kommer att hjälpa till i utredningen.
USA:s utrikesminister Antony Blinken talade med sin israeliska motsvarighet Yair Lapid och kom överens om att samarbeta med andra allierade "för att undersöka fakta, ge stöd och tänka över kommande steg", enligt ett uttalande från utrikesdepartementet.
På fredagen twittrade Yair Lapid att han hade beordrat Israels diplomater att driva på FN-åtgärder mot "iransk terrorism".
"Jag har instruerat ambassaderna i Washington, London och FN att arbeta med sina samtalspartner i regeringen och de relevanta delegationerna i FN: s högkvarter i New York", skrev han på Twitter.