39-åringen förlorade i två raka set, 6–7, 5–7, mot den 44:e-rankade argentinskan Nadia Podoroska.
Det var dessutom Williams 1000:e match på WTA-touren i karriären, som slutade i hennes 149:e förlust.
Förlusten är ett tufft slag för världsåttan i uppladdningen till grand slam-turneringen Franska mästerskapen som inleds den 30 maj.