Högerbacken tvingas kasta in handduken på grund av en lårskada, meddelar Englands fotbollsförbund på sin hemsida.
Alexander-Arnold fick tidigare en plats i Englands EM-trupp, trots att det spekulerades att förbundskapten Gareth Southgate inte skulle ta ut honom. Men i onsdagens träningsmatch mot Österrike – som England vann med 1–0 – var olyckan framme.
"Vi önskar dig en snabb återhämtning", skriver Englands fotbollsförbund på Twitter.
Southgate kommer att kalla in en ersättare efter söndagens EM-genrep mot Rumänien.
England inleder EM mot Kroatien den 13 juni.