Tre av spelarna – däribland West Ham-backen Vladimir Coufal – har skickats hem efter ett nattklubbsbesök.
Tjeckien möter Moldavien på måndagen och behöver en poäng för att säkra en EM-plats.
Coufal, backkollegan Jakub Brabec, Aris Saloniki, och forwarden Jan Kuchta, Sparta Prag, blev tagna på bar gärning när de besökte en nattklubb i centrala Olomouc, enligt den tjeckiska tidningen DNES.
"De har fundamentalt brutit mot interna regler under lördagskvällen och har lämnat landslagssamlingen med omedelbar verkan", skriver det tjeckiska fotbollslandslaget på X.