Efter 143 landskamper meddelar 34-åringen på sociala medier att han inte kommer att spela mer i landslaget.
"De har varit en ära att få representera mitt land och ta det till den absoluta toppen som mästare i världen och i Europa, att vara kapten och att spela så många matcher, med varierande utgång men alltid efter att ha gett allt", skriver Busquets bland annat.
"Sergio Busquets är en ikon inom spansk fotboll, en exemplarisk idrottsman, ett oklanderligt proffs och en odiskutabel ledare", säger Luis Rubiales, ordförande i det spanska fotbollsförbundet i ett pressmeddelande.
Busquets har de senaste åren varit lagkapten i "la roja" och är den senaste i "den gyllene generationen" att tacka för sig i landslaget.
Tillsammans med bland andra Iker Casillas, Xavi och Andrés Iniesta vann han EM 2008 och 2012 samt VM 2010. Tillsammans med Casillas, Xavi, Iniesta, Andoni Zubizarreta, Fernando Hierro och Sergio Ramos har han spelat flest VM-turneringar (4) i den spanska fotbollshistorien och tillsammans med Ramos och Casillas har han spelat flest VM-matcher (17).