Fotbollsförbundet säger att rapporterna om utnyttjande av arbetare under arenabyggen "inte kan ignoreras" och uppmanar Qatar att legalisera samkönade relationer.
Australien tar därmed bladet ur munnen i den skarpaste kritiksalvan hittills av någon av de deltagande nationerna vid årets fotbolls-VM.
16 australiska landslagsspelare deltar i en video där kritiken mot Qatar riktats.
– De senaste två åren har varit en resa för att förstå och få veta mer om situationen i Qatar, säger lagkaptenen Maty Ryan i klippet.
– Vi har lärt oss att beslutet att arrangera VM i Qatar har resulterat i lidande och skador för oräkneliga av våra medmänniskor som arbetar där, säger Jackson Irvine.
I videon konstateras att spelarna inte är experter, men att fotbollsförbundet inför ställningstagandet varit i kontakt med människorättsorganisationer som Amnesty International och fackförbund.
Spelarna medger att det har skett flera förbättringar inom Qatar de senaste åren, men att mer behöver göras och att de hoppas att deras agerande bidrar till en ihållande förändring även efter det att mästerskapet är avslutat.
Den förre landslagskaptenen Craig Foster, mittfältare i Crystal Palace, berömmer spelarna för att de träder fram och levererar sitt budskap.
– Det är så mycket press i fotboll att inte prata om det här. Så det här kräver mod från de aktiva. Spelarna bär i grund och botten den börda som lagts på dem av Fifa och andra förbund runt om i världen, säger han.
Australien spelar i grupp D i VM och möter Frankrike, Tunisien och Danmark.