Ledecky tog ändå sitt första guld i Tokyospelen lite senare när hon vann damernas historiska första OS-final på 1 500 meter fritt.
Mötena mellan uppstickaren Titmus och 24-åriga stjärnan Ledecky i OS-frisimmet är något av höjdpunkterna på damsidan. De väntas också ställas mot varandra på 800 meter fritt och i lagkappen 4x200 meter fritt.
Efter segern på 400 meter fritt följde Titmus upp med att vinna även halva distansen över amerikanskan som var regerande mästare i båda grenarna efter att ha vunnit fyra OS-guld i Rio 2016.
För australiskan har OS-guldsamlandet precis börjat.
Vass avslutning
Ariarne Titmus vann precis som tidigare i veckan genom en vass avslutning.
Men det var inte Ledecky som utmanade – utan Siobhan Haughey, Hongkong.
Haughey, som tog Hongkongs första OS-medalj i simning, ledde med ungefär 25 meter kvar – men Titmus, trea i sista vändningen, spurtade starkt, tog sig förbi på slutet och vann med 42 hundradelar på 1.53,50.
Katie Ledecky blev bara femma och Penny Oleksiak, Kanada, tog bronset.
Titmus kommer från en förhållandevis liten stad på Tasmanien.
– Jag är från en liten stad och det här visar bara att om du tror på dig själv så kan du lyckas till hundra procent om du jobbar för det, säger hon till ABC News.
Första segern
Efter två missade guldchanser fick Katie Ledecky till det på 1 500 meter fritt en stund senare. Den var med för första gången på OS-programmet där damernas längsta distans tidigare varit 800 meter fritt.
Storbritannien tog en överlägsen seger på herrarnas 4x200 meter fritt och USA missade medalj och blev fyra. Stjärnan Caeleb Dressel avstod lagkappen och kan nu som mest vinna sex OS-guld.
Britterna var med 6.58,58 bara tre hundradelar från USA:s världsrekord från 2009.
Fortfarande är det bara Australiens damer, på 4x100 meter fritt, som satt världsrekord i Tokyo och det första individuella dröjer.