Kaia Kanepi fyller 37 år nästa månad och är grand slam-turneringens äldsta spelare på damsidan. Estniskan är rankad 46:a i världen och slog ur underläge mot Muguruza, rankad tia.
Men Kanepi visade att gammal är äldst.
Efter att ha förlorat första set klart med 2–6 vände Kanepi och tog hem de två efterföljande seten med 6–3, 6–4, och avancerade vidare till nästa omgång.
Därmed är Muguruza, som har två grand slam-titlar att stoltsera med, utslagen i Franska mästerskapens första omgång för andra året i rad.
Tunisiskan Ons Jabeur kom till Paris som färsk vinnare i Madrid och med 17 segrar på grus i år. På Roland Garros väntade en tvärnit.
Polskan Magda Linette vann överraskande med 3–6, 7–6 (7–4), 7–5.
Jabeur, seedad sexa och i förhandssnacket en av titelfavoriterna, fick inte mycket att stämma efter det första vunna setet i öppningsmatchen.
Linette utnyttjade Jabeurs misstag.
– Jag försökte bara vara fokuserad efter det första setet och försökte göra det svårt för henne. Jag var glad för varje poäng jag tog, säger polskan som fick behandling för en skada i ena benet efter det förlorade första setet.
En lyckad taktisk omdisposition ledde till seger och andra omgången.
– Jag spelade snabbare och min sving var snabbare. Jag ville sätta henne i lägen där hon inte kunde röra sig lika bra, säger Linette.